PiggyBac CRISPRベクター

CRISPR/Cas9ベクターは新しく開発されたゲノム編集ツールのひとつで、素早く効率的にゲノムの標的DNA配列に変異を導入できます（同様にZFNやTALENなどもよく利用されます）。

Cas9はRNA誘導性DNAヌクレアーゼの一種で、プラスミドやバクテリオファージなど外来遺伝子の侵入を防ぐ原生生物の自然免疫システムの一部です。Cas9は18‐22ntの標的配列と配列特異的な相互作用をするガイドRNA（gRNA）と複合体を形成します。gRNAの標的配列へのハイブリダイゼーションによってCas9はゲノムの標的配列を切断します。

CRISPRによる遺伝子ターゲティングには細胞内で標的配列特異的なgRNAとCas9が共発現している必要があります。Cas9とgRNAをひとつのベクター(all-in-oneベクター)から発現させるか、Cas9とgRNAをそれぞれ独立したベクターから発現させることによって共発現が可能になります。all-in-oneベクターを使うメリットは、CRISPRゲノム編集に必要なすべてのコンポーネントをひとつのベクターのみで供給でき、技術的に簡便である点です。独立したgRNAベクターとCas9ベクターの同時導入を試みても、両ベクターがすべての細胞に同時に導入される確率は大変低くなります。別の方法として、Cas9を安定して大量に発現する細胞もしくは生体にgRNAを発現させる方法がありますが、かなりの時間と労力が必要になります。当社のall-in-oneベクターはCas9とgRNAをPiggyBacベクターから発現できるため、上記の困難を回避できます。

            当社のPiggyBac CRISPRベクターは宿主哺乳類細胞ゲノムへのCas9とgRNAの高効率かつ恒久的な導入が可能です。PiggyBac CRISPRシステムはE.coliプラスミドとして設計された2つのベクターから構成されます。ひとつめはヘルパープラスミドとよばれ、トランスポゼースを持ちます。もうひとつはトランスポゾンプラスミドと呼ばれ、２つのITR（inverted terminal repeats） が転移されるDNA配列を挟み込むかたちで配置されています。Cas9とgRNAはITRのあいだにクローニングされます。gRNAはヒトU6プロモーターから発現して、Cas9を標的DNAサイトへと誘導します。ヘルパープラスミドとトランスポゾンプラスミドが標的細胞に同時導入されると、ヘルパープラスミドから発現したトランスポゼースはトランスポゾンプラスミド上の2つのITRを認識してITRとそのあいだの領域を宿主ゲノムへ挿入します。piggyBacトランスポゾンはゲノムのTTAA配列に挿入されます。挿入の過程でTTAA配列は複製されて挿入場所の両端に配置されます。

当社のPiggyBac CRISPRベクターは実験目的に応じてシングルgRNA発現用とデュアルgRNA発現用のどちらかを選択できます。シングルgRNA発現ベクターはgRNA発現用のヒトU6プロモーターをひとつ、デュアルgRNA発現ベクターはふたつ持ちます。シングルgRNA発現ベクターは遺伝子ノックアウトなどの従来のCRISPRゲノム編集用途に利用され、デュアルgRNA発現ベクターは対となるゲノムサイトを同時に標的とする必要がある用途に利用されます。使用用途として次のようなケースがあります。１）標的サイトに対してペアとなるgRNAとhCas9ニッケース変異体（hCas9-D10A）を使用して、二本鎖DNAのそれぞれの鎖にニック（一本鎖切断）を入れてDSB（double strand break:二本鎖切断）を起こしてゲノム編集を実行する。２）対となるgRNAペアを利用して2ヵ所のDSBを作り出し、そのあいだの配列の欠失を作り出す。３）2つのgRNAによる2つの遺伝子の同時編集。

当社のPiggyBac CRISPRベクターはふたつの改良型Cas9(hCas9とhCas9-D10A)を利用できます。ヒトのコドン使用頻度に最適化されたhCas9は標的サイトで効率的にDSB（二本鎖切断）を作り出し、ニッケース変異体であるhCas9-D10Aは一本鎖ニックを標的サイトに作り出します。hCas9-D10Aが標的サイトのそれぞれのDNA鎖にたいするgRNAペアと共に使用されると、hCas9-D10Aは両DNA鎖それぞれに一本鎖ニックを入れることによって標的サイトにDSBを作り出します。この方法はシングルgRNAよりもオフターゲット効果の可能性を低下させ、標的配列への特異性を高めることができます。

piggyBacはクラスIIトランスポゾンであり、カット＆ペースト様式（転移後に自身のコピーを残さない）で転移します。クラスIトランスポゾンは転移のあとに自身のコピーを残す、コピー＆ペースト様式をとります。ヘルパープラスミドは一過的に細胞内に導入され、時間経過とともに失われます。ヘルパープラスミドの宿主細胞からの消失によってゲノムへ挿入されたトランスポゾンは恒久的に固定化されます。もしヘルパープラスミドが再導入されるとトランスポゾンはゲノムの挿入位置から再び転移することがあります。

当ベクターシステムに関する詳細な情報ついては下記の論文を参照してください

当社のPiggyBac CRISPRベクターシステムはE.coliでの高コピー数複製、広範な細胞タイプへの高効率な導入および導入遺伝子の高い発現量を実現します。PiggyBac CRISPRベクターはひとつのベクターからCas9とgRNAを発現できるように設計されています。また、実験目的によってシングルgRNAもしくはデュアルgRNAを発現できるベクターを選択可能です。

簡便さ: CRISPR/Cas9はgRNAと標的ゲノムサイトの配列の相同性によって機能するために、設計が簡単で分かりやすくなっています。当社のPiggyBac CRISPRベクターは哺乳類細胞にCas9とgRNAを同時に導入できるように設計されています。これによってCRISPR遺伝子編集に必要なすべてのコンポーネントを一度に導入できるので、Cas9とgRNAを独立したベクターで導入するよりも簡便で時間を節約できます。

ベクターDNAを恒久的に導入できる：従来の遺伝子導入法は時間経過ととも宿主から導入した遺伝子が失われます。増殖細胞でこの問題は顕著になります。piggyBacシステムはトランスポゾンによって宿主ゲノムへ遺伝子を挿入するので、ベクターDNAは恒久的にゲノム内に維持されます。

簡便さ：ウイルスを使わないプラスミドベクターによる遺伝子導入法は簡便で高い技術を必要としません。

細胞タイプが限定される：PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。非増殖細胞は一般的に増殖細胞よりも効率が悪く、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。プラスミドによる遺伝子導入はin vitro用途に限定され、in vivo用途にはほとんど使用されません。これはPiggyBACシステムにも当てはまります。

オフターゲット活性：CRISPR/Cas9システムはある程度のオフターゲット活性があります。一般的にはTALENシステムの方が低いオフターゲット活性を持つといわれています。しかしながら、標的のゲノムサイトに対してhCas9-D10AニッケースとgRNAを２つ使用して2本鎖DNAのそれぞれの鎖に対してニックをいれ、DSBを作り出す方法ならばオフターゲット活性を大幅に減少させることができます。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

U6 promoter: ヒトU6 snRNAのプロモーター。small RNAの転写をするRNAポリメラーゼIIIによってgRNAを高レベルで発現する。

gRNA: Streptococcus pyogenes由来のCas9（SpCas9）用のgRNA。

Terminator: gRNAの転写を停止する。

CBh promoter: チキン β‐アクチンプロモーター。下流のCas9ヌクレアーゼを発現する。

Cas9 protein: Cas9（hCas9もしくはhCas9-D10A）遺伝子。

SV40 late pA: SV40（Simian virus 40）のlateポリアデニレーションシグナル。上流Cas9の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）、視覚化用遺伝子（EGFPなど）、デュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。