PiggyBac FLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクター

PiggyBac FLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクターはベクタービルダーの高効率piggyBacベクターシステムとCre応答性FLEX条件的遺伝子発現システムを組み合わせています。それによってプラスミドベクターを利用したトランスフェクションによるCre応答性FLEXスイッチの宿主細胞ゲノムへの恒久的な挿入を可能にします。FLEX(Cre-On)システムは2ペアのLoxPバリアント組み換え配列を目的遺伝子の両側に配置して、Cre非存在下の完全な発現不活性化とCre存在下での遺伝子の反転にともなう発現の活性化を実現します。

FLEX (Cre-On)スイッチは2ペアのLoxPバリアント（オリジナルのLoxPと変異が導入されたLox2272）組み換え配列から構成されています。プロモーターに対して逆向き（アンチセンス方向）にクローニングされた目的遺伝子の両側にLoxPペアとLox2272ペアの片側がひとつずつ配置されています。LoxPとLox2272はLox2272‐LoxPの順番で、アンチパラレル配向で配置されます。どちらのLoxPバリアントもCreに認識されますが、同じLoxP配列間でだけ組み換えが発生します。Cre非存在条件では目的遺伝子はプロモーターに対して逆向きなので発現されません。Cre存在条件では、まずLoxPペアもしくはLox2272ペアのどちらか一方で起こった組み換えによって遺伝子の反転が起こります。遺伝子の反転にともなって目的遺伝子の発現が活性化されます。続いて、残り一方のペアに組み換えが起こることによってLoxPペア、Lox2272ペアの片側が取り除かれます。この結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272配列がひとつずつ残される形となり、Cre存在条件でも組み換え反応が起こることはありません。

PiggyBacベクターシステムはプラスミドベクターによって目的遺伝子を宿主細胞ゲノムに恒久的に導入できる、非ウイルス性の簡便なシステムです。当システムは2種類のプラスミドベクター、トランスポゾンプラスミドとトランスポゼース（PBase）発現ヘルパープラスミドから構成されます。トランスポゾンプラスミドはTR（Terminal Repeat）のペアによって挟まれた転移領域を持ちます。FLEX Cre-Onスイッチは、この領域に配置されます。PBaseとトランスポゾンプラスミドが目的細胞に同時にデリバリーされると、PBaseがトランスポゾンプラスミド上の両末端のITRを認識し、宿主ゲノム中のTTAA配列にITRと目的遺伝子を含む転移領域を組み込みます。Creの存在下でCre-LoxPによる遺伝子配列の反転により遺伝子発現が活性化されます。トランスポゼース(PBase)は、1）一過的なヘルパープラスミドのトランスフェクションもしくは、２）IVT (in vitro transcribed) PBase mRNAを目的細胞へマイクロインジェクションする、2通りの方法でトランスポゾンを目的細胞にデリバリーできます。どちらの方法でも、トランスポゼースは短い間のみ発現します。ヘルパープラスミドの消失もしくはPBase mRNAの分解によってゲノムに挿入されたトランスポゾンは安定化します。

PiggyBacは、カット＆ペースト型のクラスIIトランスポゾンに分類され、自己コピーを残さずに転移します（クラスIトランスポゾンは、コピー＆ペースト型で、自己コピーを残して転移します）。ヘルパープラスミドを再び導入することにより、ゲノムに痕跡を残すことなくpiggyBacトランスポゾンを取り除くことができます。

当ベクターシステムはトランスジェニック動物の作製に特に適していますが、培養組織細胞にも利用することも可能です。当ベクターが導入されたトランスジェニック動物個体と組織特異的にCreを発現する個体を交配することで、Creとベクターの両方を持つ子孫が生まれ、Creが発現している組織細胞において遺伝子が特異的に発現します。

当ベクターシステムに関する詳細な情報については下記の論文を参照してください

PiggyBac FLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクターは哺乳類細胞と生体でCreを利用した条件的遺伝子発現を可能にします。初期状態では目的遺伝子が発現することはありません。しかしCreレコンビナーゼの共発現によって遺伝子方向の反転、恒久的な発現活性化が起こります。Creによる組み換え反応後、目的遺伝子の発現は使用するプロモーターの活性制御にしたがいます。

PiggyBac FLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクターとヘルパープラスミドはE.coliでの高コピー数複製、広範な標的細胞へ高効率なベクター導入および高レベルの遺伝子発現を可能にします。

厳密な遺伝子発現切り替え：LoxP-Stop-LoxPを含む他の条件的遺伝子発現システムでは特定の条件下で低レベルの発現漏れが起こります。しかし当システムではCreによる組み換え反応前に目的遺伝子は逆向きに配置されているので、発現は完全に抑制されます。

安定した遺伝子活性化: Cre組み換え反応は目的遺伝子をプロモーターに対してセンス方向に反転します。遺伝子の反転後に続いて起こる組み換え反応によって、LoxPバリアントペアのそれぞれ片側が取り除かれます。結果、目的遺伝子の両端にはLoxPとLox2272がひとつずつ配置される形になり、Cre存在条件でもこれ以上の組み換え反応が起こることはありません。組み換え反応終了後は、任意のプロモーターを使用して目的遺伝子を発現します。

恒久的なベクターDNAの挿入： 従来の方法で宿主細胞へ導入されたベクターDNAはほとんどが時間経過とともに失われます。この問題は増殖速度の速い細胞では特に顕著になります。piggyBacトランスポゾンプラスミドとヘルパープラスミドを使用した遺伝子導入法ならば、トランスポゾンを利用したベクターDNAの宿主ゲノムへの挿入によって恒久的な目的遺伝子の導入が可能です。

簡便さ：プラスミドベクターは従来の方法によって細胞に導入されます。パッケージング操作が必要なウイルスと比べると非常に簡便です。

大きなサイズDNAが許容可能: 当社のPiggyBac FLEX(Cre-On)条件的遺伝子発現ベクターは全体で~30kbのDNA配列を扱うことができます。当ベクターのバックボーン部分（トランスポゾン関連、およびCreレコンビナーゼ関連）は３.1kbほどですので、残りを任意の目的で使用することができます。

細胞タイプが限定される：PiggyBacベクターの細胞への導入効率は細胞タイプに依存します。一般的に非増殖細胞は増殖細胞よりも導入効率が悪くなり、プライマリ細胞は不死化細胞株よりも効率が悪くなります。いくつかの細胞タイプ、神経細胞や膵臓β細胞への遺伝子導入は非常に困難になります。これらの細胞タイプによる限定はpiggyBacシステムにも当てはまります。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat。piggyBacトランスポゼースは2つのITR（5' ITR と3' ITR ）を認識してITRとそのあいだのDNA配列を宿主ゲノムへ挿入する。

Promoter: 目的遺伝子を発現するプロモーター。

Lox2272: Creレコンビナーゼの組み換え配列。LoxP配列に二か所の塩基置換が導入されている。LoxP配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272 配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

LoxP: Creレコンビナーゼの組み換え配列。Lox2272配列とは適合しない。Cre存在下ではLoxPとLox2272配列はそれぞれ適合する配列と組み換え反応が起こる。

ORF: 発現させたい目的遺伝子。プロモーターの極性方向とは逆向きに配置されている。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。プロモーターの極性方向とは逆向きに配置されている。

rBG pA: ラビットβ-グロブリンポリアデニレーションシグナル。目的遺伝子の転写を停止する。

CMV promoter: ヒトCMV immediate earlyプロモーター。マーカー遺伝子を普遍的に発現する。

Marker: 薬剤選択用遺伝子（ネオマイシン耐性など）や視覚化用遺伝子（EGFPなど）、もしくはデュアルレポーター遺伝子（EGFP/Neoなど）。ベクターが導入された細胞の薬剤選択もしくは可視化を可能にする。

BGH pA: ウシ成長因子ポリアデニレーションシグナル。マーカー遺伝子の転写を停止する。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。