レンチウイルス遺伝子発現ベクター

レンチウイルスベクターシステムは、哺乳細胞へ恒久的に遺伝子を導入できる優れた方法で、現在では、一般的なトランスフェクション法と共に、最もポピュラーな遺伝子導入方法の1つです。レンチウイルスベクターシステムでは、多様な細胞種において、カスタマイズされたプロモーターから目的遺伝子を発現させることができます。

レンチウイルスベクターは、レトロウイルスファミリーに属するHIVに由来し、野生型レンチウイルスはプラス鎖線状RNAゲノムを有しています。

レンチウイルスベクターは、まず、大腸菌プラスミドとして構築し、その後、複数のヘルパープラスミドと共にパッケージング細胞へトランスフェクトします。パッケージング用のウイルス産生細胞では、5’側と3’側の両方にLong Terminal Repeats (LTR)を持ち、その間に挟んでデザインしたDNA領域がRNAに転写されます。このウイルスゲノムは、ヘルパープラスミドによって生成されたウイルスタンパク質にパッケージングされウイルス粒子となります。レンチウイルスはウイルス産生細胞から細胞培養液上清へ放出されますが、この上清液は直接あるいは濃縮後、目的の研究用に準備したターゲット細胞の感染に使用されます。

精製したウイルス粒子をターゲット細胞に感染させると、ウイルス粒子はターゲット細胞内に取り込まれます。搭載しているウイルスRNAはDNAに逆転写された後、ターゲット細胞（宿主）のゲノムにランダムに組み込まれます。ベクター構築の際にデザインした、5’LTRから3’LTR間にクローニングされている目的遺伝子やコンポーネントは、このように宿主ゲノムへ恒久的に挿入されることになります。 

レンチウイルス作製用のプラスミドベクターは、天然のレンチウイルスから調節遺伝子およびアクセサリー遺伝子の機能を欠損させ、構造遺伝子を欠失させています。ヘルパープラスミドはウイルスパッケージングに最低限必要な遺伝子のみコードし、ウイルス産生細胞に共発現させています。このため、このようにして製造されたレンチウイルス作製用のプラスミドベクターから生成されるウイルスは、ターゲット細胞に感染させても、自己複製能を持たないため複製はされず、安全に配慮されたシステムとなっています。

本ベクターシステムの詳細については、以下の文献をご参照下さい。

第3世代のレンチウイルスベクターで、大腸菌では高コピー数で複製されます。また、高力価でのウイルスパッケージング、および様々なタイプの細胞へウイルスを導入することが可能です。宿主ゲノムへの組み込み効率にも優れ、トランスジーンを高レベルで発現することができます。

ベクターDNAの恒久的な組み込み: 一般的なトランスフェクションでは、ベクタープラスミドは時間の経過と共に失われるため、DNAの導入は一過性で、分裂速度の早い細胞においては特に不安定となります。しかしながら、レンチウイルスでは、ウイルスベクターが宿主ゲノムへ組み込まれるため、恒久的に遺伝子を導入することができます。

高いウイルス力価: ベクタービルダーのレンチウイルスベクターは、高力価でパッケージングすることができます。弊社のパッケージングサービスでは、10^9 transduction unitユニット（TU/ml）以上の力価でウイルスを回収できますが、この力価で、適切な用量を使用すれば、培養哺乳細胞に100％の効率で遺伝子を導入することが可能です。

大変広範な感染細胞指向性: ベクタービルダーのパッケージングシステムではウイルス表面に水泡性口炎ウイルス（VSV）のGタンパク質をウイルスに外套しています。VSV-Gエンベロープタンパク質は幅広い感染宿主細胞の指向性を持つため、一般的に研究によく用いられる生物種由来の細胞さらに哺乳動物以外の特定の生物種由来の細胞に、効率よく遺伝子を導入することができます。さらに、分裂細胞と非分裂細胞、初代培養細胞と樹立細胞株、幹細胞と分化細胞、接着細胞と非接着細胞など、ほぼ全てのタイプの哺乳細胞に導入することができます。また、神経細胞のように、通常のトランスフェクションでは導入が難しい細胞においても、レンチウイルスベクターならば簡単に導入することができます。ベクタービルダーのシステムでパッケージングされたレンチウイルスベクターは、ある種の細胞には導入が難しいアデノウイルスベクターや、非分裂細胞には導入が難しいMMLVレトロウイルスベクターよりも幅広い指向性を持っています。

内部プロモーターのカスタマイズが可能: ベクタービルダーのレンチウイルスベクターは、ゲノムに組み込まれると、5’LTR内部のエンドジェナスなユビキタスプロモーターは活性を失うようにデザインされています。そのため、目的遺伝子の発現プロモーターは、ユーザーが自由にカスタマイズすることができます。

均一な遺伝子導入: 一般的に、ウイルスによる導入は比較的バラツキが少なく、細胞間で均一にベクターを導入することができます。反対に、一般的なトランスフェクション法では、ある細胞では高コピー数、またある細胞では低コピー数あるいは全く導入されなかったりと、プラスミドベクターの導入は非常に不均一になります。

in vitro とin vivoの両システム互換性: レンチウイルスは主に培養細胞へのin vitroで導入する場合に使用されますが、生きた動物へ導入する場合にも使用することができます。

安全への配慮: ベクタービルダーは2つの工夫によって安全性を高めています。1つ目は、ウイルスパッケージングに必要な遺伝子を複数のヘルパープラスミドに分散させていることです。2つ目は、ウイルスベクターが宿主ゲノムへ組み込まれると、5‘LTRにあるプロモーター活性が不活化するようにデザインされていることです。パッケージングや導入の際に、複製能力を持ったウイルスが出現する可能性はゼロで、作業者の安全に配慮したシステムにデザインされています。

搭載できるDNAフラグメントの限度サイズ: 野生型レンチウイルスのゲノムサイズは～9.2kbです。ウイルスパッゲージングと導入に必要なコンポーネントの～2.8kbを差し引くと、挿入できるフラグメントのサイズは~6.4 kbに制限されます。ベクターがこのサイズ制限を超えると、回収できるウイルス力価は著しく低下します。レンチウイルスベクターには、通常、目的遺伝子に加え、プロモーターや薬剤耐性など、複数の機能的コンポーネントの挿入が必要となるため、これら複数の機能的コンポーネントに大きなORFが加われば、容易に6.4kbを超過し、ウイルス力価に影響が及んでしまいます。

テクニカル習熟度: レンチウイルスベクターの使用では、ウイルス産生細胞で生きたウイルスを作成し、ウイルス力価を測定する必要があります。これらの作業は、一般的なプラスミドのトランスフェクションに比べテクニックを習熟する必要があり、また手間もかかります。

RSV promoter: パッケージング細胞内で、ウイルスRNAの転写を駆動し、転写されたRNAは生きたウイルス内にパッケージングされます。

Δ5' LTR: HIVの5‘long terminal repeatの一部が欠失した配列です。野生型レンチウイルスの5’LTRと3’LTRのシークエンスは同じです。5' LTRと3' LTRは同方向でウイルスゲノムの両端に位置しています。ウイルス導入の際、3' LTRのシークエンスは5' LTRの上にコピーされます。野生型ウイルスでは、5' LTRはウイルスゲノムの転写を駆動するプロモーター、3' LTRは転写を終結させるためのポリＡ付加シグナルとして機能します。ベクタービルダーのレンチウイルスベクター5' LTR-ΔU3は、ウイルス転写因子Tatによって促進される、LTRのプロモーター活性に必要な領域を欠失しています。プロモーター機能は5' LTR-ΔU3上流に配置したRSVプロモーターによって代替されるため、この欠失がウイルスRNA産生に影響を与えることはありません。

Ψ: ウイルスRNAをウイルスにパッケージングするために必要なHIV-1パッケージングシグナルです。

RRE: HIV-1 Rev response element　ウイルスパッゲージングにおいて、ウイルスRevタンパク質によるウイルスRNAの核外輸送を促進します。

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract　標的細胞への感染において、ウイルスゲノムの核内輸送を促進します。 これにより、宿主ゲノムへの組み込みが向上し、高い導入効率が得られます。

Promoter: 目的遺伝子を駆動するプロモーターをここに配置します。

Kozak: Kozakコンセンサスシークエンス。真核細胞において翻訳開始を促進させるため、目的遺伝子ORFの開始コドン直前に配置します。

ORF: 目的遺伝子のOpen reading frameをここに配置します。

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element　 パッケージング細胞においてウイルスRNA安定化させ、ウイルス力価を向上させます。

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. マーカー遺伝子のユビキタスな発現を駆動します。

Marker: 薬剤選択遺伝子（例：ネオマイシン耐性）、可視化遺伝子（例：EGFP）、あるいはデュアルレポーター遺伝子（例：EGFP/Neo）。ベクター導入細胞を選択および可視化することができます。

ΔU3/3' LTR: HIV 5‘long terminal repeatのU3領域が欠失した配列です。ウイルスベクターが宿主ゲノムへ組み込まれると、5’LTRのプロモーター活性は失われます。（これは、ウイルス導入の際、3' LTRのシークエンスが5' LTR上にコピーされるためです。）ΔU3/3' LTRのポリ付加シグナルによって、ウイルスパッケージング、および宿主ゲノムへの組み込み後に産生される上流からの全ての転写が終結します。

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal　初期ポリA付加シグナル。パッケージングにおいて、3’LTR以降のRNA転写を終結させます。パッケージング細胞でウイルスRNAの機能レベルを高め、ウイルス力価を向上させます。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。アンピシリンによってプラスミド導入大腸菌を選択します。

pUC ori: pUCの複製起点であるpUC oriをコードするプラスミドは、大腸菌において高コピー数で保持されます。